绒山羊CRISP1与PDIA3相互作用以及CRISP1在睾丸和顶体反应前后精子中定位的探讨

【摘要】哺乳动物受精是精子和卵子相互结合、融合形成合子的过程。它既是胚胎发育的开始,也是一个新生命的起点。但是,人们对受精的分子机制却知之甚少。综合该方向的研究成果和本实验室的研究结果,我们猜测在精卵融合过程中,富含半胱氨酸的CRISP1可能与二硫异构酶PDIA3之间存在相互作用。因此本实验解析这两种蛋白之间的相互作用以及CRISP1在睾丸和顶体反应前后精子中的定位。本实验选用pET-32a作为原核表达载体,构建了原核表达载体pET-CRISP1.将pET-CRISP1转化进大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,成功得到了融合蛋白HIS-CRISP1.利用切胶纯化的方法分离纯化融合蛋白HIS-CRISP1,经纯化的HIS-CRISP免疫昆明(KM)小鼠,成功制备了小鼠抗绒山羊CRISP1腹水多克隆抗体。用自制小鼠抗绒山羊CRISP1腹水多克隆抗体分别处理绒山羊睾丸组织切片和精子涂片,免疫组织化学和免疫细胞化学检测结果显示,CRISP1广泛存在于绒山羊睾丸组织中；在未发生顶体反应的绒山羊精子中,CRISP1主要存在于精子尾部；在发生了顶体反应的绒山羊精子中,CRISP1主要存在于精子的赤道区。本实验构建了酵母表达载体pGAD-CRISP1、pGAD-CRISP1(A)、pGAD-CRISP1(B)和pGBK-PDIA3,本实验室保存有酵母表达载体pGBK-PDIA3(A)和pGBK-PDIA3(B),将上述酵母表达载体两两组合进行酵母双杂交实验,结果显示,绒山羊CRISP1与PDIA3之间存在相互作用,且PDIA3(A)段与CRISP1发生了相互作用。同时,本实验构建了带有HIS标签的pcDNA-CRISPl和带有HA标签的pcDNA-PDIA3真核表达载体,将两种真核表达载体共转染至293T细胞中,利用免疫共沉淀技术westernblotting结果显示,绒山羊CRISP1与PDIA3之间存在相互作用。此外,本实验还筛选出了绒山羊CRISP1单克隆稳定细胞系,以便稳定表达绒山羊CRISP1蛋白。
【作者】郭维伦；
【导师】邢万金；
【作者基本信息】内蒙古大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】绒山羊；CRISP1；PDIA3；蛋白相互作用；精卵融合；

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